读特客户端·深圳新闻网2022年8月25日讯（记者 李旖露）近期，深圳湾实验室系统与物理生物学研究所李刚课题组在《自然》子刊Nature Communications期刊发表了题为“Spatiotemporal-resolved protein networks profiling with photoactivation dependent proximity labeling”的研究论文，论文开发了一种基于单线态氧邻近标记、且具有高时空分辨率的蛋白质互作网络分析的蛋白质组学平台，突破了目前广泛采用的邻近标记方法的局限性。

PDPL流程示意图。（深圳湾实验室供图）

蛋白质相互作用网络是细胞过程的基础，也是生物学最重要的研究工具之一。高时空分辨率地揭示蛋白相互作用图谱将为破译生物作用通路、解析病理学分子机制以及疾病治疗发挥重要作用。目前广泛采用的邻近标记方法均存在一定的局限性。例如TurboID方法利用“活化酯”作为标记中间体，其半衰期为分钟级，反应活性较差，导致标记背景较高，且存在一定的内源性生物素产生的背景；而APEX方法需要利用双氧水处理细胞，催化生成生物素-苯酚自由基，尽管其半衰期提高到毫秒级，但是其依然存在标记背景高的问题，且双氧水处理会影响对氧化敏感的蛋白或者细胞通路，并会对细胞产生一定的毒性。

研究人员认为，发展新型邻近标记方法的关键在于寻找反应活性更好的中间体进行标记，以达到高时空分辨率。研究人员认为，单线态氧是更好的介导邻近标记的活性中间体，并发展了一种基于光激活依赖的新型邻近标记平台（PDPL）。

作者将光敏蛋白和目的蛋白在细胞内进行融合表达，在蓝光照射下激发产生单线态氧，从而使邻近氨基酸残基被氧化，发生极性反转，使其从亲核性氨基酸变为亲电性，进而与含有氨基的化学探针发生“接力”反应，完成邻近标记过程。

此项研究在前期进行了大量的筛选和优化。通过优化光敏蛋白以及对7种不同化学探针的优化和筛选，研究人员最终将标记信噪比提高到8-20倍，为后续的研究奠定了基础。随后，作者通过免疫荧光成像以及各种活性氧物种的淬灭剂或稳定剂等对照实验，证明了单线态氧调控此邻近标记过程。

为了探索标记过程的化学机理，需要确定蛋白质组中的哪些氨基酸被修饰，以及相应的修饰分子量，因此作者采用了化学蛋白质组流程TOP-ABPP方法，并利用MSFragger的FragPipe平台，进行开放式搜库。

研究结果表明，PDPL邻近标记方法，尤其适用于通过间接相互作用形成的、大分子量蛋白复合体中蛋白酶底物的鉴定。

综上，研究人员发展了一种新型的基于单线态氧的邻近标记方法，该方法具有高时空分辨率，且光敏蛋白约为12kD，约是APEX蛋白（27kD）的二分之一，约是TurboID（35kD）的三分之一，这种小尺寸蛋白可以扩展相互作用网络研究的应用范围，作者相信该方法将会具有重大的应用前景。

李刚特聘研究员为本文的唯一通讯作者，课题组研究助理翟彦生为本工作第一作者，该研究工作完全在深圳湾实验室独立完成。该研究得到了国家自然科学基金、广东省区域联合基金以及深圳湾实验室开放基金等经费支持。